On Medicine

Anno X, Numero 1 - febbraio 2016

La resistenza batterica sta assumendo un ruolo sempre più rilevante per diverse specie batteriche, soprattutto per quanto riguarda le Enterobatteriacee, le quali tra i diversi meccanismi di resistenza, hanno acquisito la capacità di produrre ESBL e, grazie a ciò, si stanno diffondendo sempre più nei nosocomi. Lo scopo dello studio è quello di rilevare la presenza di tali ceppi nel P.O. “G. Moscati” di Aversa e di valutarne l’incremento dal 2008 al 2014; inoltre il nostro obiettivo è stato anche quello di valutare quale specie sia isolata con maggior frequenza. Tutto ciò è stato possibile grazie all’uso di sistemi automatici e piastre cromogeniche. I risultati ottenuti da questo lavoro indicano che a partire dal 2008 si è avuta una diffusione rapida di Klebsiella pneumoniae ed Escherichia coli, i quali risultano resistenti a diverse classi di antibiotici, a volte mostrando sensibilità solo ad antibiotici in sinergia.

Introduzione

I batteri presentano notevoli capacità di adattamento e grazie a questa loro caratteristica, nonché alla possibilità di rimescolamento genico, essi hanno da sempre potuto sviluppare meccanismi di resistenza antibiotica. La resistenza è fornita da diversi fattori, come la struttura della membrana, la presenza di pompe di efflusso per la fuoriuscita dell’antibiotico dalla membrana o degli enzimi inattivatori. Tra questi, il fattore che negli ultimi anni sta causando un aumento dei fallimenti terapeutici, è dato dalla sempre crescente capacità dei batteri di produrre β-lattamasi a spettro esteso, le ESBL. Le ESBL sono una classe di enzimi appartenenti alle β-lattamasi (cioè proteine capaci di idrolizzare gli antibiotici β-lattamici), in grado di creasre una resistenza verso l’intera classe antibiotica, includendo anche le oximo-cefalosporine e i monobattami.

Ceppi produttori di ESBL

Attualmente i ceppi in cui le ESBL sono maggiormente riscontrate sono le Enterobatteriaceae e i microrganismi non fermentanti.
Le Enterobatteriacee raggruppano molti generi di batteri normalmente presenti a livello dell’apparato intestinale. Ne sono un esempio E. coli e K. pneumoniae. Sono batteri Gram negativi, glucosio fermentanti, mobili grazie alla presenza di flagelli o anche immobili, come nel caso di Klebsiella. Possono essere capsulati o privi di capsula. Sono batteri che comunemente causano enteriti infiammatorie e non infiammatorie, manifestazioni sistemiche delle infezioni intestinali. La loro virulenza è data da fattori quali fimbrie adesive per l’attacco alle mucose e produzione di endotossine.1 Tra i non fermentanti è noto Acinetobacter, un germe Gram negativo immobile che appartiene alla famiglia delle Moraxellacee. Sue possibili infezioni possono causare setticemie, polmoniti, ascessi cerebrali e altre manifestazioni sistemiche.2

Le ESBL e i meccanismi di resistenza

Un batterio viene definito produttore di ESBL quando il gene originale della resistenza antibiotica viene mutato oppure quando viene inglobato nel proprio genoma un plasmide che determina uno spettro di resistenza maggiore (AmpC).3,4 Non è sempre facile determinare la presenza di un ESBL e per questo sono stati creati test che ne permettono l’identificazione e la conferma fenotipica.
L’identificazione viene eseguita mediante uno screening, il quale consiste nel saggiare la sensibilità a diversi β-lattamici (cefotaxime,ceftazime, aztreonam). Se il test risulta positivo e si hanno resistenze a questi antibiotici si procede con il test di conferma fenotipica, che va a valutare l’attività del β-lattamico da solo e in presenza dell’inibitore delle lattamasi, in modo da valutarne il recupero di attività (test doppio disco e test di combinazione). Nella pratica di laboratorio quando un antibiogramma mostra la presenza di questo marker in ceppi batterici, è bene effettuare test fenotipici di conferma. Inoltre, a differenza di quanto proponeva il Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), lo European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) impone di lasciare il valore delle MIC come tale senza apportare modifiche.
Il meccanismo di resistenza delle ESBL si basa sull’idrolisi dei β-lattamici, la quale avviene a livello del loro sito attivo. Qui la serina terminale dell’enzima porta un gruppo ossidrile, il quale si rende responsabile di un legame non covalente con l’anello β-lattamico. Successivamente l’anello β-lattamico viene attaccato da un ossidrile libero e ciò consente la formazione di un legame covalente con l’enzima. A questo punto avviene l’idrolisi dell’anello, che libera l’enzima e rende inoffensivo l’antibiotico.3,5,6,7 Data la grande rilevanza di ceppi produttori di ESBL, lo scopo del nostro lavoro è valutare l’incidenza dei ceppi produttori di ESBL nel periodo 2008-2014 presso il P.O. “G. Moscati” di Aversa e di confrontala con quella degli anni precedenti, in modo da valutarne un eventuale incremento.

Materiali e metodi

Tutti i materiali provenienti dai vari reparti sono stati seminati su opportuni terreni e incubati a 37°C per circa 24 h. Dopo la fase di incubazione è stata valutata la presenza di colonie batteriche sospette produttrici di ESBL. In particolar modo si è fatto anche uso di terreni cromogeni che consentono un più facile riconoscimento di ceppi produttori di ESBL. In seguito al riconoscimento presuntivo si è poi passati alla formazione di subculture per avere una coltura pura, e successivamente all’identificazione e ai saggi di sensibilità, grazie a sistemi automatizzati quali Phoenix (BD) e Vitek 2 (BioMerieux).

Risultati

Nel periodo di riferimento, al nostro laboratorio sono pervenuti 12.720 campioni provenienti da diversi distretti corporei. Di questi, 456 sono risultati produttori di ESBL, mentre la restante parte non presentava questo marker di resistenza. Si è provveduto, inoltre, a calcolare l’incidenza delle specie trovate annualmente. I risultati del nostro studio sono riportati in Tabella 1.

Tabella 1. Incidenza delle specie produttrici di ESBL.

Discussione

I batteri presentano notevoli capacità di adattamento grazie alle quali hanno acquisito notevole capacità di resistenza antibiotica. Tra i meccanismi di resistenza, a destare maggiori preoccupazioni è la capacità dei batteri di produrre β-lattamasi a spettro esteso, le ESBL, una classe di enzimi capaci di idrolizzare gli antibiotici β-lattamici, creando una resistenza verso l’intera classe antibiotica.
La necessità del nostro lavoro è nata, quindi, dalla ormai crescente diffusione di questi ceppi, i quali stanno diventando i padroni dei vari nosocomi. Dai dati ottenuti dal nostro studio, si evince, come mostrano le Figure 1 e 2, che, a partire dall’anno 2008 si è avuto un notevole incremento di questi ceppi.

Figura 1. Andamento delle ESBL nel periodo 2008-2014 presso il P.O. “G. Moscati”.

Figura 2. Andamento delle diverse specie di ESBL nel periodo 2008-2014 presso il P.O. “G. Moscati”.

In particolar modo si osserva una crescita esponenziale di Klebsiella pneumoniae (Figura 3A-B), seguita a ruota, quasi di pari passo, dalla crescita di E. coli (Figura 4A-B ).

Figura 3. Incidenza di Klebsiella spp. presso il P.O. “G. Moscati” nel periodo 2008-2014.

Figura 4. Incidenza E. coli presso il P.O. “G. Moscati” nel periodo 2008-2014.

L’Acinetobacter spp. solo in due casi ha mostrato la capacità di produrre ESBL. Per quanto riguarda le altre due specie batteriche, K. pneumoniae ed E. coli, nel periodo 2008-2014 hanno avuto un trend di crescita elevato. Questo fenomeno era stato notato anche in passato e, infatti, uno studio condotto presso il P.O. “Moscati” di Aversa nel biennio 2006-2007, lasciava presagire che il numero dei germi ESBL fosse destinato ad aumentare. I dati dai noi ottenuti non fanno altro che confermare quanto già detto in precedenza e, inoltre, sono in accordo con dati di altre realtà ospedaliere.8 Siccome questi patogeni sono anche stabili a temperatura ambiente e su diverse superfici, essi albergano nei nosocomi e, per tale motivo, stanno aumentando le campagne volte alla sensibilizzazione e all’istruzione del personale, in modo da limitare quanto più possibile la loro diffusione accidentale. Attualmente sono in atto numerosi studi volti a ridurre la diffusione di tali germi o, perlomeno, a cercare qualche molecola nuova che possa segnare la svolta nella lotta contro di essi. L’unica soluzione che sembra al momento applicabile è testare la sinergia tra più tipi di antibiotici, in modo da valutare se l’azione combinata di due o più molecole possa realmente essere di beneficio, non solo in vitro, ma, soprattutto in vivo. Alcuni studi riportano un sinergismo significativo tra classi di antibiotici come colistina e tigeciclina, in associazione con rifampicina.9 In un altro recente studio, invece, si è posta l’attenzione sul sinergismo tra vancomicina e colistina,10 che ha dato discreti risultati, come quello tra meropenem e colistina.11 L’analisi che però lascia ben sperare è stata condotta da Safarika e collaboratori, i quali hanno studiato il sinergismo tra colistina e levofloxacina. Questa sinergia ha dato una percentuale di successo molto alta, anche se non per tutte le specie in questione.12

A cura di:
Cusano E, Cassarano M, Di guida C, Fedele G, Mungiguerra M.
P.O. “G. Moscati” di Aversa. Patologia Clinica-settore Microbiologia. ASL CE Via Gramsci, Aversa CE

Bibliografia

1. Kaiser FH, Bienz KA, Eckert J, Lindenmann J. Handbook di Microbiologia Medica 8a edizione, Mediserve, 1993;197-218.
2. Garrity GM, Bell Aj, Lilburn T. Bergey’s manual of sistematic bacteriology 2005, 2nd edition 2:25-437.
3. Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory 2002;51:1-15.
4. Livermore DM. Clin Microbiol Infect 2008;2:3-10.
5. Livermore DM. Clin Microbiol Rev 1995;8:557-84.
6. Tietz A, Francioli P, Widmer AF. Swiss-Noso 2004;11:1-8.
7. Philippon A, Arlet G, Jacoby A. Antimicrob Agents Chemother 2008;46:1-11.
8. Rapporto 2013 sulle antibioticoresistenze e sull’uso di antibiotici rilevati nelle strutture ospedaliere della Campania. Assessorato alla sanità della regione Campania. Direzione generale per la tutela della salute ed il coordinamento del Sistema Sanitario Regionale.
9. Dong X, Chen F, Zhang Y, et al. J. antibiot (Tokyo) 2014;6:677-80.
10. Percin D, Akyol S, Kalin G. GMS Hyg Infect Control 2014;19:9.
11. Stein C, Makarewicz O, Bohnert JA, et al. PLoS One 2015;10(6).
12. Safarika A, Galani I, Pistiki A, Giamarellos-Bourboulis EJ. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2015;34:317-23.